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Isolation of plant nuclei suitable for flow cytometry from species with extremely mucilaginous compounds: an example in the genus Viola L. (Violaceae)

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Author(s): Cires, Eduardo | Cuesta, Candela | Fernández Casado, María Ángeles | Nava, Herminio S. | Vázquez, Víctor M. | Fernández Prieto, José Antonio

Journal: Anales del Jardín Botánico de Madrid
ISSN 0211-1322

Volume: 68;
Issue: 2;
Start page: 139;
Date: 2011;
Original page

Keywords: Chromosome number | flow cytometry | genome size | mucilaginous compounds | nuclear DNA content | ploidy levels | section Melanium | section Viola | Número cromosomático | citometría de flujo | tamaño genómico | compuestos mucilaginosos | contenido de ADN nuclear | niveles de ploidía | sección Melanium | sección Viola

ABSTRACT
Flow cytometry analysis has been widely applied in the determination of nuclear DNA content and ploidy level in many organisms. Despite being the most appropriate method for DNA content measurement, flow cytometry also presents some limitations. A fairly common, but little-studied problem is the effect on measurements of the presence of secondary metabolites. A good example is the genus Viola, which is composed of 525-600 species distributed worldwide. These species have proved to be problematic for flow cytometric analyses due to the release of extremely mucilaginous compounds into the nuclear suspension. In this work, the genome size of 13 species of Viola using flow cytometry are presented for the first time. Despite obtaining histograms with high coefficients of variation, we here present an optimized protocol to remove cytoplasmic compounds, particularly mucilaginous ones, from plant nuclei that pave the way for its application to estimate the genome size of other species exhibiting similar problems. Statistical analyses revealed significant differences between sections Viola and Melanium, and within each section (P < 0.001). Furthermore, statistically significant differences were not detected among samples of the same species.El análisis mediante citometría de flujo ha sido aplicado de modo general para determinar el contenido de ADN nuclear y el nivel de ploidía en muchos organismos. A pesar de ser el método más adecuado para medir la cantidad de ADN, esta técnica también presenta algunas limitaciones. Un problema bastante común, aunque poco estudiado, es el efecto de los metabolitos secundarios en los resultados obtenidos. Un ejemplo respecto a la presencia de estos compuestos se encuentra en el género Viola, compuesto por 525-600 especies distribuidas por todo el mundo. Las especies de este género ya han sido previamente descritas como problemáticas en los análisis de citometría de flujo debido a la presencia de compuestos extremadamente mucilaginosos en las suspensiones de núcleos. En el presente trabajo se analiza por primera vez el tamaño genómico de 13 especies del genero Viola mediante el empleo de citometría de flujo. A pesar de los altos valores mostrados en los coeficientes de variación de los histogramas, se presenta un protocolo optimizado para eliminar compuestos citoplasmáticos, y más concretamente mucilaginosos de las suspensiones nucleares, siendo de aplicación en la estimación del tamaño genómico de plantas con problemas similares. Los análisis estadísticos mostraron diferencias significativas entre las secciones Viola y Melanium, así como dentro de cada sección (P < 0,001). Además, no se encontraron diferencias significativas entre aquellas muestras pertenecientes a la misma especie.

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